动物肠道及肠道微型生物,感染家禽后不引起其余治病症状

弯曲杆菌是一种微需氧、菌体呈弧形或螺旋形的革兰氏阴性细菌,在世界范围内广泛存在,可感染人和动物引起发病,如感染人引起肠炎,临床症状从轻微到严重腹泻…

益生菌有很多种类,每一种类又有很多菌株,每一个菌株的功能性都有很大的不同,一般而言,这种功能性又具有菌株特异性的特征,所以,在益生菌的开发和应用中,必须对每个菌株的功能性进行研究和评估。

1肠道菌群及其分布

弯曲杆菌是一种微需氧、菌体呈弧形或螺旋形的革兰氏阴性细菌,在世界范围内广泛存在,可感染人和动物引起发病,如感染人引起肠炎,临床症状从轻微到严重腹泻等表现不一,极少数病例发展为自身免疫性疾病如反应性关节炎、格林-巴利综合征、Miller-Fisher综合征等,给人类健康带来严重威胁;感染动物如牛、羊、猪等引起母畜流产、不孕、乳房炎以及幼畜腹泻等临床表现;感染家禽后不引起任何临床症状,被认为是家禽肠道内的一种共生菌,但成为人感染的主要来源。目前弯曲杆菌属中已鉴定19个种,其中以空肠弯曲杆菌和结肠弯曲杆菌对人的感染最为普遍,据统计在人弯曲杆菌感染病例中空肠弯曲杆菌所占比例近90%,结肠弯曲杆菌约占10%。

益生菌的使用在人类历史中已超过数千年。最早的益生菌应用可追溯到旧约圣经、可兰经及佛教经典中,益生菌的安全性及功能性对于人和动物健康的增进作用已无庸置疑。然而功能性益生菌则是在益生菌的基础上,更多地凸显其功能性,即是针对不同的症状,筛选出最具保健功效的菌种。科学文献中有许多功能性益生菌的报告,像是Lactobacillusparacasei、Bifidouslongum、LGG等能调节过敏性免疫反应;Lactobacillusreuteri可抑制胃幽门杆菌;Lactobacillusrhamnosus抑制白色念珠菌,Lactobacillusacidophilus可有效地促进消化等,都是功能性益生菌在维护人和动物肠胃健康的科研和应用实例。

1.1肠道正常菌群的概念在动物体内环境中通常有一层微生物或微生物层,在正常情况下即动物处于健康状态时,并未表现异常或致病现象,称这一层微生物为正常菌群或固有菌群和原籍菌群。这些菌群是动物机体内环境中不可缺少的组成部分,对动物宿主是有益无害的。

流行病学调查显示全球每年约发生4亿例人弯曲杆菌感染病例,如美国每年的病例超过200万,西欧国家的病例约占人口数的1%。在临床症状方面,发展中国家与发达国家的临床表现明显不同,发展中国家5岁以下的儿童发病率比较高,临床表现以腹泻为主,成年人由于早期接触或感染而对该菌产生了免疫力,通常不表现临床症状或非常轻微;而在发达国家,成年人感染后常出现比较明显的临床症状。因而该病在发达国家受到更广泛的重视,如美国由该病带来的经济损失可达80亿美元。

动物肠道及肠道微生物

1.2肠道菌群的分布人和动物的胃肠道栖息着大约30属500多种细菌,主要由厌氧菌、兼性厌氧菌和需氧菌组成,其中专性厌氧菌占99%以上,而仅类杆菌及双歧杆菌就占细菌总数90%以上。

弯曲杆菌在家禽特别是鸡群中广泛存在,调查显示世界范围内鸡群中弯曲杆菌的带菌率在60%-80%之间。在自然情况下,鸡群2-3周龄之前由于母源抗体的存在很少感染该菌,但随着母源抗体的消失,一旦鸡只出现感染,在几天内通过水平传播可感染整个鸡群,且鸡只带菌量非常高,盲肠内粪便带菌量可达到1010cfu/g,感染后持续带菌直至屠宰。研究显示,人弯曲杆菌病的感染源主要来自带菌的家禽及其产品。据统计人弯曲杆菌感染病例中30%-40%直接来自于污染的禽肉,而分子分型技术更显示人弯曲杆菌感染病例中80%与家禽弯曲杆菌有关。家禽弯曲杆菌感染虽然严重威胁着人类健康和食品安全,但目前尚无行之有效的控制措施。一方面,目前尚未成功研制商品化的疫苗来控制此病原菌;另一方面,抗生素的滥用导致该菌的耐药性非常普遍。因而在此背景下,通过控制家禽弯曲杆菌的污染来降低人感染该菌是最直接有效的手段。对人弯曲杆菌感染的定量风险评价结果显示,当禽肉中弯曲杆菌量降低100倍时,人感染弯曲杆菌的几率就会降低30倍;另一项风险评估结果也显示当禽肉中弯曲杆菌量降低10倍、100倍和1000倍时,人感染弯曲杆菌的几率就会相应地降低48%、85%和96%。

动物通过其胃肠道来实现对食物的消化和吸收,动物肠道内壁覆盖着大量粘膜,小肠内壁呈折叠状,形成小肠绒毛,从而使肠道内拥有很大的比表面积。一方面,大的表面积有利于食物有效的消化和营养成分的吸收,另一方面,通过微生态学的研究表明,在肠粘膜上定殖的大量微生物同肠粘膜一起形成了一道严密的菌膜屏障,维护着动物机体肠道健康,减少感染几率,促进营养物质吸收和增强免疫抗御作用。

肠道个体菌群分为3个部分:

鉴于此,本文根据传染病的基本特点,从病原、宿主和传播途径3个方面入手,分别简述目前在弯曲杆菌、家禽品系及相关环境因素的最新控制措施,对人弯曲杆菌感染的控制和食品安全将具有重要意义。

动物肠道不仅是消化吸收的重要场所,同时也是“应激反应的中心器官”和“多脏器功能衰竭的始动器官”,又是机体内最大的细菌和内毒素库。研究表明,正常生理状态下,肠道内含有近500种细菌。成年动物肠道菌群主要集中在结肠和末端小肠,可多达1013个不同类型、不同含量的细菌,约是动物内真核细胞的10倍,相当于肝脏的重量。在上段小肠中,需氧菌及革兰氏阴性细菌占绝大多数。回盲部细菌密集,厌氧菌占优势,如类杆菌、双歧杆菌、真菌、乳酸菌及梭状芽孢杆菌。结肠中厌氧菌的数量更多,约1011-1012CFU/g,其优势菌为类杆菌、双歧杆菌和真菌。另外,革兰氏阴性球菌、梭状芽孢杆菌、肠球菌、肠杆菌等也常见于结肠中。盲肠腔内的细菌约25%为兼性厌氧菌,尤其是肠杆菌属,这种细菌在粪便中约占1%。动物肠道中有些细菌是潜在有害的,即条件致病菌,这类细菌在一定时机可产生毒素,侵犯黏膜,引起炎症反应。而另一类有益于健康的肠道微生物是人体内正常菌群的成员,或是能调节体内菌群平衡而对人体无毒无害的一些细菌。在诸多细菌共存情况下,不同菌种之间的拮抗作用,宿主与细菌之间借助对营养物质的吸收和利用,在消化道中形成相互作用的关系,维系着消化道微生物生态系统的平衡。一般情况下,体内有益菌的数量大大超过有害菌的数量。但是,当出现一些情况时,比如接受抗生素治疗,饮食变化、环境变化等,有益菌和有害菌的平衡关系可能被打乱,从而动物胃肠道不适。

生理性细菌与宿主共生关系,为专性厌氧菌,是肠道的优势菌群,如双歧杆菌、类杆菌、优杆菌和消化球菌等是膜菌群的主要构成者,具有营养及免疫调节作用。

1.弯曲杆菌

肠道微生物的功能多样性

条件致病菌与宿主共栖,以兼性需氧菌为主,为肠道非优势菌群,如肠球菌、肠杆菌,在肠道微生态平衡时是无害的,在特定的条件下具有侵袭性,对人体有害。

鉴于鸡只孵化后2-3周龄内母源抗体的存在而可避免弯曲杆菌的感染,提示研制弯曲杆菌疫苗仍是控制或降低家禽弯曲杆菌感染的最有效手段。目前在家禽弯曲杆菌商品化疫苗尚未出现的情况下,鸡只屠宰上市前降低家禽体内弯曲杆菌的载量,同样可有效地降低人感染弯曲杆菌的风险。

肠道粘膜上的微生物组成与动物宿主本身的特征情况有很大关系,受到很多因素的影响。如机体的免疫防御能力,多形核白细胞和上皮细胞分泌的抗菌物质,肠道粘膜的组成以及上皮细胞的再生速度等。在整个微生物大家庭中,既有合作又有竞争。微生物之间互相竞争肠道粘膜上可以粘附的位置以及营养物质。同时,微生物通过分泌一些物质来达到抑制其它微生物生长的目的。只有那些能够粘附在肠道粘膜和上皮细胞表面的微生物,才可以生存在肠道粘膜上。此外,微生物通过在粘膜上紧密的共同作用,最大程度地作用于机体组织。

病原菌多为过路菌,长期定植的机会少,生态平衡时,这些菌数量少,不会致病,如果数量超出正常水平,则可引起人体发病,如变形杆菌、假单胞菌和常为韦氏梭菌等。口腔内的菌群高度复杂,但经过胃被胃酸破坏,对胃肠道影响很小。?

1.1主动免疫

肠道微生态学家对肠道细菌的研究集中于几种优势细菌,健康成年动物粪便中大约80%的细菌构成6种优势菌,分别是类杆菌属、双歧杆菌属、乳酸杆菌属、Clostridiumleptum菌属、Clostridiumcoccoides菌属和肠杆菌属,而肠道细菌主要由粪便细菌与肠道黏膜细菌构成。一系列的临床和动物试验已使用多种方法发现患有肠道炎症性疾病的动物和健康对照动物肠道菌群存在不同,肠炎动物发作期与健康对照组粪便菌群比较,肠杆菌和肠球菌呈有意义增加,尤以肠链球菌数增加显著,而酵母菌变化不显著,乳酸杆菌也略有减少,主要原籍菌双歧杆菌、真杆菌、类杆菌和消化链球菌都呈有意义减少,双歧杆菌检出率尤其低。采用定量斑点吸印杂交和温度梯度凝胶电泳技术,比较结肠炎动物和健康对照者的粪便细菌,发现结肠炎会导致肠道杆菌属有显著升高,在其粪便标本中存在具有黏附和侵袭特性的大肠杆菌。此类大肠杆菌菌株致病因子包括黏附素、溶血素和致坏死毒素。应用原位荧光杂交技术分析肠炎动物和健康对照者的肠道黏膜细菌,发现肠炎动物肠道中细菌浓度较健康对照者高,并且这些细菌大多具有黏附性,定居在黏膜层,但是不黏附于肠上皮细胞。因此,动物胃肠道的炎性疾病、腹泻等与黏附性的条件致病菌如大肠杆菌等侵袭粘膜有关,病原性的肠道细菌及其产物,如细菌脂多糖,脂蛋白(lipoproteins)等,能刺激肠黏膜免疫系统,诱发动物肠黏膜免疫系统功能紊乱,产生异常的免疫反应,导致慢性肠炎、腹泻等疾病,病原微生物抗原经抗原递呈细胞的作用而激活T淋巴细胞,再经T细胞产生的具有不同激活效应的细胞因子而激发不同特征的免疫病理损伤。

胃的酸性环境极大地抑制了微生物的繁殖,减少了进入小肠的微生物数目。在无酸的胃中细菌数会明显增多。胃内除了幽门螺杆菌或相关的菌种外,大多数是革兰氏阳性的需氧菌,如链球菌、葡萄球菌、奈瑟菌、乳酸杆菌和念珠菌,细菌浓度通常小于103/ml。幽门螺杆菌是真正的胃内细菌,它是引起胃炎的主要致病因子,是溃疡病的重要致病因子。

研制弯曲杆菌疫苗直接应用于人是最直接有效的控制人弯曲杆菌病的手段,但目前最大的困难在于动物感染模型的建立,因为目前常用的动物模型如雪貂、BALB/c小鼠、灵长类动物等都难以通过感染弯曲杆菌来稳定地、可重复地模拟人的疾病过程,从而给免疫效果的评价带来困难。因而研制家禽弯曲杆菌疫苗来降低或预防家禽感染弯曲杆菌将更为现实,家禽弯曲杆菌疫苗主要通过家禽肠道内弯曲杆菌的定植情况来进行免疫效果的评价。目前研制的家禽弯曲杆菌疫苗类型主要集中于如下3种:

肠道菌群失调,伴随着肠道菌群的种类、数量和功能发生了改变,改善的方法包括:广谱抗生素治疗,但这种方法在杀灭条件致病菌的同时,也会导致肠道正常菌群会被杀灭或抑制,同时抗生素的使用往往使体内各处的敏感菌受到抑制,而使耐药菌乘机在体内繁殖生长,导致二重感染;通过添加对肠道健康有益的活菌来达到修复肠道菌群平衡的目的。一般而言,通过试验证明肠道摄入一定量的某种微生物对动物肠道健康具有一定的功能性,那么该微生物就被认为“有功能性的”或者说“益生菌”,即是源添加的对维护动物肠道健康和菌群平衡的有益的微生物,也就是益生菌。关于益生菌在控制肠炎性疾病中可能的作用机制包括与肠黏膜上皮细胞紧密结合,提高黏膜防御屏障,阻止致病菌的定植和入侵;提高抗炎细胞因子水平;与病原菌竞争性黏附于上皮细胞,促进上皮细胞分泌黏液使其在黏膜和微生物之间形成保护层,防止栖生菌易位;增强巨噬细胞对病原菌的吞噬以及非T细胞依赖性IgA的分泌。但最近的研究表明

小肠是个过渡区,肠液流量大,足以将细菌在繁殖前冲洗到远端回肠和结肠,十二指肠和空肠相对无菌,含菌浓度为0~105/ml,主要菌种是革兰氏阳性的需氧菌,包括链球菌、葡萄球菌和乳酸杆菌。在远端回肠中,革兰氏阴性菌开始超过革兰氏阳性菌,经常存在大肠菌类和厌氧菌,含菌浓度为10.3~10.7/ml。

1.1.1全菌灭活疫苗

益生菌在肠炎发病中还可能存在其他机制包括:通过阻止细菌黏附、易位或产生抗菌物质来抑制病原体;阻断促炎细胞因子的分泌;3)调节肠道菌群,并且产生对肠道功能有重要作用的营养物质。由于益生菌与动物免疫系统之间的交互作用最直接,加上益生菌疗法是从根本上去调节免疫反应,因此应用范围十分广泛。且益生菌很安全,没有副作用,除改善肠道不适外又能有效缓解过敏症状。

通过回盲瓣,细菌浓度急剧增加100倍以上,达1010~1012/ml,厌氧菌超过需氧菌10.2~10.4倍,主要的菌种是拟杆菌、真杆菌和双歧杆菌以及厌氧的革兰氏阳性球菌,正常人结肠中主要菌群是相同的,并且在一段时间内保持稳定状态。这些肠道固有细菌在维持肠道功能健康方面具有举足轻重的作用。

全菌灭活疫苗通常是最简单有效的疫苗研制策略,因而在弯曲杆菌疫苗中开展得也最早。近年来研制的人弯曲杆菌全菌灭活疫苗已进入Ⅲ期临床试验,Ⅱ期在志愿者体内临床试验结果证实具有较好的免疫原性。在家禽方面,上世纪90年代开始多篇文献报道利用福尔马林灭活弯曲杆菌制备全菌灭活疫苗,无论是卵内免疫或2周龄后的免疫,均可刺激机体产生特异性IgA、IgG和IgM,且弯曲杆菌在鸡体内的定植能力显著降低。但弯曲杆菌的遗传多样性以及其菌体脂低聚糖可诱发人GBS发生的风险仍严重阻碍全菌灭活疫苗的研制和使用。

益生菌的种类多样性

2肠道菌群对动物免疫的影响及机理?

1.1.2亚单位疫苗

益生菌有很多种类,每一种类又有很多菌株,每一个菌株的功能性都有很大的不同,一般而言,这种功能性又具有菌株特异性的特征,所以,在益生菌的开发和应用中,必须对每个菌株的功能性进行研究和评估。益生菌的种类多样性体现在以下几个方面:

肠道菌群形成一个庞大而复杂的微生态系统,有重要的生理意义。包括抵御病原体侵袭、刺激机体免疫器官的成熟、激活免疫系统及参与合成多种维生素、调节物质代谢等作用。?

亚单位疫苗明显具有安全、特异性强的优点,可作为亚单位疫苗候选的弯曲杆菌蛋白需具有位于菌体表面、能为免疫系统识别、具有较好的表达丰度、可在宿主体内表达以及在不同血清型菌株中高度保守等特点,同时该蛋白应为弯曲杆菌特异性,即不影响宿主体内其它共生菌的正常生存。目前,弯曲杆菌鞭毛蛋白是研究较多的一类亚单位疫苗候选蛋白,如FlaA、FlaC、FspA1、FspA2等,这些鞭毛相关的蛋白均可刺激机体产生较强的免疫反应,但仅能少量降低鸡体内弯曲杆菌的载量或没有明显效果。借鉴流感嗜血杆菌荚膜多糖抗原疫苗的成功经验,为研制弯曲杆菌荚膜多糖结合抗原疫苗提供了另一种思路,目前在小鼠或灵长类动物试验中具有一定的效果。随着弯曲杆菌转录组和蛋白质组学的研究,更多的候选蛋白如cadF、MOMP、Peb1、CmeC、CfrA、Omp18、Omp50、Cj0420、Cj0018c、Cj1643等被用于鉴定对宿主的免疫原性及对弯曲杆菌定植的影响。

益生菌自身的耐受能力各异。益生菌株一般是经口摄入,在到达肠道前需先接受胃酸及胆盐考验,胃酸胆盐之耐受能力决定了益生菌的存活率,菌株不同,其耐胃酸胆盐能力亦有强弱之别。因此,选择合适的益生菌的前提就是需要保证菌株本身对胃酸和胆盐的耐受能力,只有较强的菌株才能顺利进入到小肠并定殖于小肠粘膜上皮细胞表面,发挥其应有的生物学功能。

2.1菌群屏障作用动物的先天性或非特异性免疫应答,亦即机体免疫系统识别和排除各种异物,主要依靠机体的屏障作用,包括正常菌群、机体的皮肤黏膜、补体等体液因子抑菌、杀菌、溶菌等作用、吞噬细胞的吞噬作用等。从现代的研究不难看出,正常菌群在机体的屏障作用中是极为重要的一个方面。?

1.1.3减毒活载体疫苗

不同种类微生物在肠道粘膜上的黏附能力有明显差异。有很多研究都发现不同种益生菌的粘附能力是不同的,而且具有宿主特异性。益生菌粘附在宿主肠道上皮细胞后可发挥占位定植的作用,以阻止病原菌与肠道粘膜受体结合产生粘附;益生菌的粘附还可以防止条件致病菌的易位,防止条件致病菌向周围不断扩散,引发有关部位感染;此外,益生菌的定植还使宿主具有调整菌群平衡、控制内毒素血症、抗肿瘤、抗衰老、免疫和营养等生理作用。因此,益生菌进入肠道后能否粘附在肠道粘膜上皮细胞表面,形成稳定的菌群,与其是否能发挥生态效应关系密切。

肠道微生物定植抗力(colonizationresistance.CR)于1971年由荷兰微生物学家Vanderwaaij教授提出,肠道内源性专性厌氧菌抑制消化道中主要属需氧菌的潜在致病菌群数量的能力。Vollaard认为粪便中需氧革兰氏阴性杆菌、肠球菌、酵母菌的数量可作为肠道微生物定植抗力的指标。双歧杆菌与肠杆菌的数量比值作为肠道微生物定植抗力指标。

由于弯曲杆菌具有诱发人GBS发生的风险,因而研制弯曲杆菌减毒活疫苗存在极大的风险,通过利用其它肠道细菌作为载体传递弯曲杆菌免疫保护抗原具有其它疫苗所无法比拟的优势。目前主要利用减毒沙门菌作为传递载体携带弯曲杆菌基因如CjaA、CjaC、CjaD、Peb1等,试验结果显示沙门菌携带的CjaA不但可诱导机体产生特异性的抗体,而且鸡肠道弯曲杆菌定植量可降低6log。

菌株不同,其特定的益生功能特性各异。每一种益生菌具有其特定的生理功能。例如文献报道中嗜酸乳杆菌GG对寄主的免疫系统有较强的调解作用,而鼠乳杆菌对大肠杆菌有较强的抑制作用。随着益生菌的研究的深入,一些新的功能特性逐渐被开发出来,如赋予益生菌特定的酶促活性,如嗜酸乳杆菌胆盐水解酶活性和罗伊乳杆菌淀粉水解酶活性等,甚至还可以以益生菌为蛋白或者抗原、抗体释放载体开发益生菌疫苗,这类功能性的益生菌,除了发挥益生菌自身定殖占位效果外,还能有利于维护自身菌体稳定,促进机体对营养物质的吸收、抵御疾病等益生功能。因此,只有对各个菌株的疗效和

2.2影响黏膜免疫分泌型球蛋白是黏膜免疫的主要效应因子,可有效中和黏膜上皮内的病原体,捕捉黏膜内层病原体,形成免疫复合物排除体外,在局部的抗感染过程中起着关键的作用。研究发现双歧杆菌抑制其他肠道菌的效果与诱生一种抗菌物质――分泌型球蛋白有关。有人研究证明乳酸杆菌粘附形成的空间占位,是防止其他菌对阴道组织附着的一个重要的保护性机制。嗜酸性乳杆菌可以在肠黏膜免疫中发挥重要的免疫监视功能。口服干酪乳杆菌能增强宿主的黏膜的免疫反应,促进肠道分泌免疫球蛋白,即使饲喂低剂量的干酪乳杆菌也能引起SIgA的分泌。又有报道短双歧杆菌能促进小肠淋巴组织集合B细胞增生,诱导淋巴组织集合的浆细胞产生大量的分泌型免疫球蛋白,进而增强机体的免疫功能。?

虽然在家禽弯曲杆菌疫苗研制方面取得了一些进展,但获得商品化的疫苗仍有很长的路,此问题的解决需要伴随着对弯曲杆菌致病机理的充分认识,而确定交叉保护性抗原以及开发新的免疫佐剂和疫苗运送系统对加快弯曲杆菌疫苗的研发将具有重要作用。

2.3促进免疫器官的生长发育益生菌能促进机体的免疫器官的生长发育、成熟,增加T、B淋巴细胞的数量,胸腺淋巴细胞免疫球蛋白含量增多,启动免疫应答。有关研究表明,实验组免疫器官内的淋巴密度密集,数量增多以及浆细胞的数量增多,中枢免疫器官的淋巴细胞和上皮网状细胞数量增多,这标志免疫器官内部淋巴细胞的发育情况和免疫功能的成熟程度,从而向外周免疫器官脾脏、盲肠扁桃体以及全身各处免疫组织源源不断的输送T、B淋巴细胞。成熟的T淋巴细胞接受抗原刺激后,激活、增殖和分化为T淋巴细胞,执行细胞免疫功能。B淋巴细胞接受抗原刺激后,激活,增殖和分化为浆细胞,由浆细胞产生特异抗体,发挥体液免疫功能,从而健全全身免疫系统,提高免疫功能。?

1.2被动免疫

2.4激活免疫因子有研究报道,益生菌能明显的激活巨噬细胞活性及细胞因子介导素的分泌,增强免疫功能,提高宿主的抗病能力。这些因子在某些情况下,可以代替免疫调节剂,因为它们不仅能刺激造血活性,而且也能增强成熟细胞的功能。例如IL1,人类颗细胞集落刺激因子及少量的肿瘤坏死因子能增强对感染的抵抗力。胃肠道中的正常菌群,生理作用十分明显,没有致病性,对宿主有免疫原性,抗肿瘤作用明显。细菌细胞表面结合的细胞因子对细菌调节机体一系列免疫反应是非常重要的。研究发现双歧杆菌能刺激免疫细胞分泌IL1,IL6的量增加,而IL1可促进T辅助细胞分泌IL2和B淋巴细胞分泌抗体,也能增强NK细胞的杀伤功能,对人类的多种肿瘤细胞具有直接的杀伤作用;同时,IL6则可促进B淋巴细胞的分化成熟,使之分泌抗体,又可直接诱导T淋巴细胞的增殖并参与了T淋巴细胞、CTL、NK细胞及LAK的细胞分化。口服丽珠肠乐后,T淋巴细胞亚群约有不同程度回升,尤以CD3,CD4及CD4/CD8比值显著。嗜酸性乳酸杆菌的细胞壁成分提取物能增加上皮内淋巴细胞的自然杀伤活性,并能促进其产生IL2。研究短小双歧杆菌作用时发现,靶细胞是巨噬细胞样的细胞,该细胞释放的活性因子直接对B细胞的分裂发挥效应。双歧杆菌WPG对T细胞的增殖和IL?2产生没有直接作用,但能诱导TNF-α,IL-β,IL-6,IL-10和IFN-α的mRNA表达。

由于母源抗体能够抑制弯曲杆菌在家禽体内定植,因而可考虑直接给家禽服用弯曲杆菌高免抗体。试验显示鸡口服弯曲杆菌高免的卵黄抗体后可明显降低攻毒弯曲杆菌的定植,粪便中排泄的弯曲杆菌数量大为降低,但停服抗体后体内弯曲杆菌数量会重新恢复。因而可考虑在鸡只屠宰前使用此控制策略来降低鸡的弯曲杆菌载量。

2.5干预细胞免疫干酪乳杆菌和保加利亚乳杆菌可激活巨噬细胞功能,刺激人体产生免疫应答。还通过巨噬细胞和T细胞、NK细胞活性的增强来增强人体的免疫;巨噬细胞、NK细胞、T细胞的活化,有益于增强周围血管和局部淋巴结中淋巴细胞的免疫,T辅助细胞、NK细胞的增加,可使抑制性T细胞减少。吸附于人体的嗜酸乳杆菌具有抗菌活性,该菌株能吸附于分化的肠道细胞上,还可在体外抵抗幽门螺杆菌,杀灭入侵菌。

1.3竞争排斥或直接作用

许多研究结果显示,乳酸菌能干预细胞免疫。乳酸菌、双歧杆菌能阻断许多微生物的入侵和粘附。口服乳酸菌或双歧杆菌能刺激人体产生非特异性免疫。乳酸菌的某些菌株:鼠李糖乳杆菌(ATCC?53103),植物乳杆菌,乳酸球菌,双歧杆菌动物亚种是肿瘤坏死因子TNF-α和IL-6的强有力的诱导剂。有些能刺激IL-10的产生,以增强免疫。?

除通过免疫学方法控制家禽弯曲杆菌的定植外,利用益生菌竞争排斥肠道中的弯曲杆菌或细菌素、噬菌体、植物源性饲料添加剂直接杀死弯曲杆菌同样可达到降低家禽肠道内弯曲杆菌载量的目的。

2.6和疫苗混合使用提高抗体水平林志新等报道,光合细菌与传染性支气管炎疫苗混合使用,具有提高实验组鸡的γ-球蛋白和对禽传染性支气管炎病毒的特异性抗体水平。也有研究表明,在ND疫苗接种前后饲用益生素,可提高鸡血清中抗NDV血凝抑制抗菌体,延长抗体的高峰期。

1.3.1益生菌

2.7具有免疫佐剂活性Himanen等研究枯草芽孢杆菌的脂磷壁酸和肽聚糖?磷壁酸复合物的生物活性时,发现两者均具有很强的免疫佐剂活性作用。地衣芽孢杆菌的免疫促进作用是机体经口服芽孢杆菌后,在肠道淋巴组织集合的抗原结合位点上直接作为免疫佐剂,或者通过调整宿主体内的微生物群,尤其是双歧杆菌菌群起主导作用,间接的发挥免疫佐剂的作用,提高机体的局部或全身防御功能。?

体外培养条件如氧浓度、培养基、温度等均能影响益生菌对弯曲杆菌的竞争作用。经过体外培养的益生菌通过饲料添加进入家禽的肠道,目前文献报道的益生菌主要包括布拉氏酵母菌、嗜酸乳杆菌、屎肠球菌、异型枸橼酸杆菌等,饲喂这些益生菌多数情况下可显著降低鸡盲肠内弯曲杆菌的载量及粪便外排量。目前对益生菌的作用机理尚不完全清楚,一般认为益生菌增殖能力非常强,在肠道内通过竞争营养使弯曲杆菌生长增殖的环境受到破坏,同时益生菌还可分泌一些活性物质如细菌素等,这些活性物质也可直接杀死弯曲杆菌,从而导致家禽肠道内弯曲杆菌数量降低。

2.8菌群失调对动物免疫的影响菌群失调是指肠道正常菌群的种类、数量和比例发生异常变化,偏离正常的生理组合,转变为病理性组合状态。临床上以腹泻为最明显症状,其他如肠道菌群中潜在致病菌引起的内源性感染和一些过敏性疾病如特异性反应性湿疹、过敏性皮炎和炎症性肠病等,被认为与菌群变化致肠一屏障功能损害及免疫紊乱有关。随着抗生素的广泛应用,特别是抗菌谱过广,应用时间长,是引起菌群失调的主要诱发因素。同位素、激素及放射治疗和化疗均可在治疗疾病的同时降低机体免疫力,影响益生菌。使人体潜在的致病菌定植。手术、外伤、感染和肿瘤以及环境恶化等均可引起菌群失调。?

1.3.2细菌素

3饲用抗生素、动物免疫和肠道微生物的相互作用?

BCN是由细菌核糖体分泌的一种小分子短肽类活性物质,肽链长度为20-60个氨基酸,分子量通常为5-6ku,具有明显的抗菌活性,为细菌分泌的一种抗菌肽。几乎所有种属的细菌可分泌BCN,目前鉴定的通常为乳杆菌、乳球菌、肠球菌、埃希菌、葡萄球菌等肠道共生菌。BCN的功能主要是发挥竞争排斥作用,保存自身而排斥异己,为肠道的一种天然免疫屏障,在维持肠道菌群平衡方面发挥重要作用。根据其生化特性不同分为3类,其中Ⅰ类和Ⅱ类研究的比较多,如作为食品添加剂的乳酸链球菌素属于Ⅰ类,抗弯曲杆菌研究中的BCN属于Ⅱ类。BCN与抗生素具有显著的差异,其作用机理主要是通过电荷或氢键非特异性结合至靶细胞表面,渗透入细菌磷脂双分子层破坏细菌膜的结构,并形成跨膜小孔,导致细菌膜内离子的流失和细菌的死亡。与抗生素长期使用产生大量的耐药性菌株相比,BCN的使用尚未见耐药性菌株的广泛出现,这可能与BCN的作用机理相关,从而为BCN的发展和应用提供了空间。

饲用抗生素在饲用抗生素促生长机制的研究方面,以前人们多从微生物角度出发,认为是抗生素对肠道微生物的抑制作用。然而,通过分析从前的研究结果,结论并非如此。佟建明等采用多次屠宰连续采样的方法对金霉素影响肠微生物的结果以及在动物不同生长阶段的变化情况进行研究,提出了饲用抗生素、动物免疫系统和肠道微生物的三元平衡的理论假设。

近几年利用BCN控制家禽弯曲杆菌的研究取得了明显的进展。Svetoch等[9]在筛选数千株家禽肠道共生菌如乳杆菌、肠球菌、链球菌、埃希菌等的基础上获得数百株在体外可抑制弯曲杆菌的菌株,并在这些菌株分离纯化和鉴定出几种对弯曲杆菌具有杀灭活性的BCN,如来自多黏类芽孢杆菌的SRCAM602,来自唾液乳杆菌的OR-7以及来自肠球菌的E-760和E50-52。这4种BCN的抑制弯曲杆菌动物试验结果显示,将BCN制备成微胶囊与饲料混合,在弯曲杆菌感染鸡后直接饲喂,可显著降低或完全清除鸡肠道内的弯曲杆菌,通过口服途径饲喂鸡可完全清除体内弯曲杆菌,证实BCN是一种非常有潜力的控制家禽弯曲杆菌的药物,但BCN的规模化生产、生物安全以及长期使用可能产生的耐药性仍是今后需要关注的问题。

他认为饲用抗生素、免疫系统和微生物通过一定时间的相互影响会逐渐建立一个三元平衡,而且这个三元平衡影响着抗生素是否具有促生长作用。三者之间建立的过程可以分为两个时期:一是反应期,在这个时期,新生的畜禽受环境中微生物以及饲料中抗原物质的刺激,机体的免疫系统开始产生免疫反应,饲用抗生素对微生物产生一定的抑制作用,同时有的抗生素还可以对免疫系统起直接的抑制作用。两种作用之和形成免疫屏障,减缓和降低动物机体的免疫反应。饲用抗生素在此期间以此对动物产生相对明显的促生长作用;二是平衡期,在这个时期,肠道微生物的数量增加到正常情况下的最高水平,抗生素与免疫系统联合作用使微生物的数量和免疫反应水平不再增加,三者的正反作用在此时形成相对平衡。此时抗生素对动物不产生相对明显的促生长作用。

1.3.3噬菌体

因此,在实际生产中,作为饲料添加剂的抗生素水平宜以预防和促生长作用的剂量而不宜以治疗剂量长期添加。?

研究显示,给肉鸡直接饲喂噬菌体可有效降低家禽体内的弯曲杆菌数量,成为控制家禽弯曲杆菌的另一种方法。当肉鸡饲喂噬菌体后,其体内的弯曲杆菌数量会急剧降低,然而几天后弯曲杆菌数量会缓慢回升,此结果提示噬菌体饲喂可应用于上市前的肉鸡,可大大降低肉鸡体内的弯曲杆菌数量,从而降低污染风险。利用噬菌体来降低家禽体内弯曲杆菌具有潜在的应用价值,但其同样存在一些问题,诸如安全性、效果持续时间以及长期使用会导致抗噬菌体菌株出现等。

4微生态制剂在畜牧业上的应用?

1.3.4植物源性饲料添加剂

动物体内的正常菌群已被广泛开发研制成微生态制剂,用于促进动物的生长、提高饲料利用率和动物疫病的防制。?

研究显示,植物特别是发酵后产生的有机酸如乳酸等饲喂家禽后可明显降低其体内的弯曲杆菌数量;其它一些来源的化学物质如酚类和香精油也具有直接杀灭弯曲杆菌的功能。由于植物源性饲料添加剂中活性物质的复杂性,添加试验结果常出现矛盾或不一致的情况,因而需要更多的研究资料来验证这种抗弯曲杆菌活性。

4.1微生态制剂的种类根据微生态制剂的用途及作用机制可分为:微生态治疗剂、微生态多功能制剂即微生物饲料添加剂、微生态助长剂等。根据微生物的种类又可分为:

2.家禽品系

芽孢杆苗制剂:目前已应用于生产的芽孢杆菌主要有蜡样芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌。制成的商品有“促菌生”、“调痢生”、“止痢灵”、“增菌素”等。

由于弯曲杆菌在家禽体内的定植是细菌与宿主相互作用的结果,因而从宿主角度出发也可研究相应的控制措施。研究显示,不同品系的鸡对弯曲杆菌的易感性存在明显的差异,而且这种差异与常染色体上的一个显性基因组密切相关。鉴于此,筛选对弯曲杆菌定殖具有抗性的家禽遗传品系对控制弯曲杆菌也具有较好的前景。当然,筛选这种抗性家禽品系应建立在对弯曲杆菌感染定植过程中家禽体内参与的基因充分认识的基础上。

乳酸苗制剂:用于微生态制剂的酸乳杆菌主要是:嗜乳酸杆菌、植物乳酸杆菌、粪链球菌等。其共同特征是大量产酸。我国最早使用的乳酶生就是用粪链球菌制成的,商品有“抗痢灵”、“抗痢宝”。

3.环境因素

酵母类制剂:目前应用的主要有啤酒酵母和石油酵母。它可为动物提供蛋白质,帮助消化,对防治畜禽消化道系统疾病起有益作用。

养禽场规范的卫生和生物安全防护措施同样适用于控制弯曲杆菌的感染和传播,如在荷兰的两个养鸡场,通过加强卫生和生物安全防护措施,以及控制鼠类和昆虫的危害,其弯曲杆菌感染率分别从66%和100%降至22%和42%。掌握家禽中弯曲杆菌污染的来源对控制该菌的传播极为关键。研究显示,经蛋垂直传播弯曲杆菌比较少见,而水平传播在弯曲杆菌感染中扮演重要的地位。由于所有的哺乳动物和鸟类均被认为是弯曲杆菌的潜在宿主,因而周围环境均有被污染的可能,养禽场潜在的污染源主要包括:①饲料和垫料;②饮水;③禽舍清洁和消毒状况;④禽舍内空气;⑤人员活动及相关的物品设备;⑥野生动物和昆虫,如鼠类、野鸟和飞虫等。针对这些污染源采取的任何防护措施都将有利于降低家禽弯曲杆菌的感染和扩散。

双歧杆菌制剂:双歧杆菌是寄生在人和动物小肠后段的正常菌群,起着维持微生态平衡的作用。

目前已充分认识到家禽弯曲杆菌的污染给人类健康和食品安全带来严重威胁,控制家禽弯曲杆菌的污染将直接降低人感染弯曲杆菌的风险。然而,目前虽然在弯曲杆菌疫苗、药物等领域取得了一定的进展,但尚未成功建立一种高效且切实可行的家禽弯曲杆菌防控措施,这有赖于继续加强对弯曲杆菌感染家禽的基础研究,特别是家禽与弯曲杆菌的相互作用机制,在此基础上才有可能彻底控制家禽弯曲杆菌,保障人类健康和食品安全。

拟杆苗制剂:拟杆菌是人和动物后肠道,在厌氧杆菌中占第一位的正常菌,上海华星生物工程研究所以脆弱拟杆菌、粪链球菌和蜡样芽孢杆菌制成的“华星宝”复合菌制剂对防治雏鸡、仔猪由沙门氏菌和大肠杆菌引起的下痢有较好的效果。?

4.2微生物制剂面临的问题微生态制剂临床应用尚有许多待解决的问题。

目前尚无微生态制剂的药代动力学的系统描述,益生菌在肠道发挥作用的有效剂量及定植所需剂量无法明确。

微生态制剂各制剂间菌数差异较大,反复筛选菌株种类、将基因重组技术引进微生态领域,增强菌株的定植能力,是很有意义的。

缺乏对微生态制剂的认识和使用经验,尤其是大规模、多中心、随机和前瞻性临床试验少,评价种类也少。

微生态制剂发挥作用确切的机制尚有待进一步阐明,目前提到的有:生态占位,定植抗力,生物夺氧,免疫调节,降低肠腔pH和细菌代谢产物抗菌作用等。每一种益生菌作用机理需进一步研究。

大部分微生态制剂不能与抗生素合用,部分限制其临床应用。如果与抗生素合用,活菌也会产生耐药性,耐药因子是否被传递。?

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